Purification engineering technology research center of Sichuan Province Natural Medicine
大地彩票技术研究中心

香豆素

  萃取溶剂对喜玛朗雅山杨梅众酚的提取与抗氧化活性的影响影响(编削)_生物学_自然科学_专业原料。fanyi

  ·萃取溶剂对喜玛朗雅山杨梅众酚的提取与抗氧化 活性的影响影响 日土·塞尼,维纳·盖瑞,寇莎亚·丹哥 摘要:喜玛朗雅山杨梅是印度喜玛朗雅山山区的一种生果,它的总众酚 含量、抗氧化活性和抗癌活性含有四种差别的溶液体例,即:80%的甲醇、酸性 甲醇、丙酮、酸性丙酮。试验注解,酸性丙酮提取物(MEAA)对喜马拉雅地域杨 梅的酚类和黄酮类化合物接管率和氧自正在基的排除率最高,而用丙酮(MEA) ,酸 性甲醇 (MEAM) , 和甲醇 (MEM) 提取物对三价铁还原举动影响较大。 用丙酮 (MEA) 和酸性丙酮提取物(MEAA)能够扩大有用的抗癌举动,导致C33A,SiHa和HeLa 细胞的存活率削减70~92%, 发现的细胞毒素水准贴近寻常转化细胞的水准。反向 的高效液相色谱理解显示了足够的没食子酸[793.74mg/100g的生果重量(FW) 正在MEA的], 杨梅素 (345.6 mg/100 g FW正在MEAA) , 咖啡酸(246.6 mg/100 gFW. 正在 MeM),, 儿茶素 (190.181mg/ 100g FW正在MEAA中)绿原酸 (246.6 mg/100 gFW正在MEAA 中), 反式桂皮酸(5.91mg/ 100g f.w.正在 MEA中),对香豆酸(5.84mg/ 100g正在MEA水 溶液中),和鞣花酸 (2.21mg/ 100gFM正在MEA水溶液中) ,说明了喜马拉雅地域的杨 梅果实提取物高的抗氧化和抗肿瘤活性。 症结词:喜玛朗雅山杨梅 抗氧化活性 抗癌活性 众酚 弁言:扩大蔬菜和生果的消磨被以为是与很众慢性疾病的危害低浸有 着亲热的闭连,比方癌症、糖尿病、血汗管疾病以及免疫功用庞杂等疾病,血管 疾病,免疫功用庞杂等疾病。行动苛重食品根源,蔬菜生果供应保卫性命的养分 素包罗矿物质、维生素以及与众种植物化学物质的沿途的酚类及黄酮类化合物。 这些酚类及黄酮类化合物是已知的自然抗氧化剂,具有很众康健煽动影响,如抗 炎, 抗过敏, 抗病毒, 抗老化, 抗致癌活性, 这些苛重归因于它们的抗氧化本质。 生果的众酚已被阐明具有重大的抗增殖性子, 它能有用的强迫大畛域的肿瘤细胞, 包罗结肠,前哨腺癌和肝癌细胞。因为对癌症防护成效和超强的抗氧化职能,激 起了全全邦看待生果贸易价钱和野生类型的众酚含量和看待百般煽动康健的性 质的研究。 喜玛朗雅山杨梅是一种分散正在印度马来亚地域和印度喜玛朗雅山脉高处的 亚热带丛林中的一种带有医学本质的野生植物, 由于它鲜味的果实和加工的副产 物,它正在本地住户中十分通行。与喜玛朗雅山杨梅果实通行相反的是,没有任何 原料纪录它的抗癌性子, 同时看待它的众酚含量和抗氧化活性的切磋也十分有限。 以是, 看待喜马拉雅杨梅生果酚和类黄酮含量调养性的体贴以及它们的百般生物 活性的切磋具有苛重的意思。 是以,目前的切磋核心正在于确定正在差别的溶剂编制 中喜马拉雅山杨梅果实中总酚和类黄酮含量, 评估的百般的抗氧化剂和抗癌活性 提取物和操纵反向液相色谱理解酚类化合物。 资料和手段:通盘的试剂均为理解纯(纯度99%) 。DPPH,NADH, 苯基甲基硫酸盐(PMS) ,硝基蓝四唑鎓(NBT) ,β 胡萝卜素,亚油酸,菲洛嗪, 儿茶素,没食子酸,咖啡酸,绿原酸,鞣花酸,杨梅黄酮,对香豆酸,反式桂皮 酸,和丹宁酸是从Sigma-Aldrich公司(斯德海姆采购,德邦) 。ABTS购自于 Calbiochem,默克得回(达姆施塔特,德邦) 。其他化学品和试剂从HIMEDIA家具 有限公司(印度孟买)置备。 喜玛朗雅山杨梅果实的判定:正在特里加瓦尔,北阿坎德邦,印度附 近的丘陵地域, 夏令四月至2010年5月时稀罕成熟喜马拉雅杨梅果实成果的时代。 用自来水冲洗生果, 并连结正在零下20℃以下,正在印度北阿坎德邦德拉敦丛林切磋 所编制植物学标本馆公司存放着带有树枝、树叶、花朵的喜马拉雅杨梅果实的样 品,它一经被植物学判定和印证。 提取物的制备和总酚类物质和黄酮类物质的评判:喜玛朗雅 山杨梅果实的众酚提取是用80%的各抽取4种差别水溶剂。分离是甲醇(MEM) 、 pH为2.0的酸性甲醇(MEAM) 、丙酮(MEA) 、和pH为2.0的酸性丙酮(MEAA) 。大略 地说,正在室温温度(RT)下,插手25克冷冻生果种子匀浆正在同化机研磨机5分钟 酿成匀称的浆液。将五克的生果浆(匀浆)倒入100-mL锥形烧瓶中,并萃取三次 用25ml溶剂30分钟振荡。将萃取液过滤,麇集,并离心(型号C24;雷米摩托车有 限公司, 新德里, 印度) , 以得回明显的提取物。 萃取物贮存正在-20℃进一步利用。 总酚含量按照标确凿定利用福林-乔高特法,以没食子酸为法式来丈量。总黄酮 含量是按照确定Meda等利用儿茶素(Sigma-Aldrich公司) ,为法式。 PPH自正在基排除活性:DPPH自正在基排除活性所援用的文献有轻细的修 改。将提取物稀释(0.1ml)与DPPH溶液同化, (0.1ml正在甲醇,5毫升) ,将同化 物静置正在阴晦处境中室温下20分钟吸光度测定是正在517纳米对甲醇没有反响的。 该DPPH自正在基排除活性外现为毫克儿茶素当量(CE)/ 100g的果重(F.W.) 。 ABTS阳离子自正在基排除活性:ABTS阳离子自正在基排除活性的测定描 述, 稀罕配制的ABTS溶液 (7毫摩尔ABTS过硫酸钾2.5mmol) 用甲醇稀释获得0.70 ±0.02的吸光度为734纳米。稀释ABTS溶液(3.0ml)与生果提取物同化(50μL) 6分钟,然后丈量吸光度正在734纳米与蒸馏水比较。丁基化羟基苯甲醚(BHA) (HIMEDIA,Ltd。创制) 。正在甲醇(5-25ug/ml)用作法式ABTS阳离子的校准自 由基排除活性。 ABTS阳离子自正在基排除活性外现为毫克当量BHA (BHAE) /100 克F.W。 超氧阴离子自正在基排除活性:超氧阴离子自正在基排除活性是被 PMS-NADH编制通过氧化天生超氧自正在基NADH的惹起的,并用NBT的还原。反响混 合物含有的Tris-HCl缓冲液(HIMEDIA。Pvt,Ltd) (16mm,pH8.0,和3ml) ,NBT (50μ M,1ml) ,NADH(78μ M,1ml)中,并萃取液(0.1ml) 。反响分离先导 与此外的PMS(10μ M,1ml)和将同化物进一步温育正在阴晦中正在25℃时代为5 分钟。正在560nm,削减的吸光度丈量与蒸馏水比较。超氧提取物的阴离子排除活 性外现为抗坏血酸当量(AAE)/ 100g的F.W.. 三价铁还原才力理解:三价铁还原才力理解是通过将2.5毫升的稀释 提取物(正在磷酸钠缓冲液,200mmol,pH值6.6)插手至铁氰化钾溶液(1%,w / v的,2.5ml) (HIMEDIA。Pvt,Ltd) ,接着温育正在50℃举行20分钟。从此,插手 三氯乙酸(10%,w / v的,2.5ml) (HIMEDIA。Pvt,Ltd)并将同化物离心,上 层 (5ml) 除去, 正在用蒸馏水 (5mL) 和氯化铁溶液 (0.1%, w / v的, 1mL) (HIMEDIA。 Pvt,Ltd) 。随后,将吸光度调至700纳米。提取的铁离子还原活性为外现为AAE/ 100g的F.W.毫克) 。 强迫脂质过氧化:强迫脂质过氧化通过β 胡萝卜素亚油酸评判模子系 统决计的。这种β 胡萝卜素溶液(2ml,0.2mg/ml的氯仿)吸移到圆底烧瓶中, 然后氯仿正在40℃条目下的蒸发,变成线 乳化剂(HIMEDIA。Pvt,Ltd) ,和100毫升蒸馏水水插手到强烈振荡烧瓶中。将 这种乳液的均分(4.9ml)与稀释的提取物(0.1ml)同化正在50℃的水浴中沿途培 养。正在470nm下,大地彩票当吸光度变为0时先导计时, 每隔20min考查一下样品,直到样 品变革了颜色时逗留计时。 含铁的金属离子螯合剂举动:含铁金属离子螯合活性测定手段是首 先取1ml果实提取物将其与浓度为每0.05ml含0.2mmol的氯化铁溶液和2ml 5mM 的菲洛嗪溶液同化,正在吸光度562nm的条目下提拔10min,与蒸馏水制制比较实 验, 记载数值。 金属螯合活性外现mgEDTA当量, 螯合活性单元为(EE)/100 g f.w。 宫颈癌细胞增殖的强迫影响:为了说明喜玛朗雅山杨梅果实提取物 的抗癌活性,咱们理解了三个差别的人类宫颈癌细胞系,这三种细胞系分离是 C33A, SiHa 和 HeLa 细胞系 (美邦人类型文明保藏、 写明 ATCC 浦那(印度) 。 C33A, SiHa 细胞需求正在最低必定提拔基(MEM)(奥德里奇)中提拔,而 HeLa 细胞需求正在 插手 10%的胎牛血清(FBS)(美邦西格玛奥德里奇公司临盆)和 1%的抗生素和抗 真菌类的药物(美邦西格玛奥德里奇公司临盆)的 DMEM 提拔基中提拔,正在 37℃ 含 5%的 CO2 的滋润的处境下提拔。 看待细胞毒性提取物看待寻常转化细胞的影响, 即人胚胎肾细胞系 HEK293(ATCC)和非转化外周血单个核细胞(PBMC) (从一个 康健的个别) ,咱们也举行了理解。HEK293 细胞是被保全正在 MEM 提拔基上的,而 外周血单个核细胞是从人类寻常的血细胞平分离出来的, 它的原代提拔正在是插手 10%的胎牛血清的 RPMI 1640 提拔液中举行的,癌细胞和非癌细胞正在各自的无酚 提拔基中举行提拔,然后往提拔基中插手生果的提取物。始末 48 小时的进一步 提拔,利用 96 孔板读写器和采用 MTT 比色法测定细胞的生计才力(fluostar 欧 米茄荧光分光光度计;BMG 工夫,奥芬堡,德邦) 。 酚类化合物的反向高效液相色谱理解:咱们采用了反向高效液相 色谱理解(1120 安捷伦工夫编制;美邦圣特塔纳 CA 公司创制)理解了没食子酸,咖 啡酸,绿原酸,鞣花酸,对香豆酸,反式桂皮酸,和丹宁酸七种酚酸和儿茶素, 杨梅酮素二种黄酮类化合物, 提取物正在 40℃烤箱中烘干, 正在将其熔解正在甲醇中, 正在滚动相中,将提取物稀释至 5 倍,这个滚动相是用 0.001mol 柠檬酸盐缓冲液 和乙腈按 7:3 的比例很合, 然后取该稀释液 20ul 装正在 C18 柱中, 用 Inertsil ods-3v 包装(250×内径 4.6ml5μm;GL 科学公司,东京,日本)变成平均滚动相。流 量连结正在 1ml/min,可检测的波长为 254nm,看待果实中百般化合物的判定是筑 立正在将保存时代和光谱组合与酚酸与类黄酮化合物法式水准比对。 统计理解:为了消除区别,将百般提取物举行独立反复试验理解,每一个参 数起码举行3次磨练,这个结果被外现为3个独立反复尝试,并盘算推算法式差。统计 利用微软软件MS Excel和棱镜3垫软件(微软,雷德蒙,WA,美邦) 。 结果与咨询: 溶剂对总酚的产量和类黄酮含量的影响: 总酚含量以没食子酸做 为法式评判(R2 = 0.9928) ,正在百般提取物中,它的转变畛域是从 900 到 2603 毫 克没食子酸等效(GAE)/ 100gf.w.(外 1) 。酚类的含量是正在酸性丙酮提取时, 提取出来的浓度最高,利用甲醛提取时浓度最低,正在酸性甲醛与丙酮提取物中, 酚类的含量适中。 (外 1) 。咱们以儿茶素为法式(R=0.99994)来测定类黄酮的 含量。利用酸性丙酮行动提取液时,提取出来的类黄酮的含量最众,大约正在 810.5± CE 23.4mg/ 100gF.W.。利用甲醇提取时类黄酮含量起码,正在 213± CE 8.mg/ 100gF.W.。用酸性甲醇和丙酮提取时觉察类黄酮的含量分离是 387CEmg/ 100gF.W.和 468mg/ 100gF.W.,(外 1),用差别溶剂提取类黄酮化合物,其才力 巨细为 MeAAMeAMeAMMeM。 抗氧化剂活性:喜玛朗雅山杨梅提取物的抗氧化活性的评判包罗自正在 基(DPPH,ABTS 阳离子,和超氧阴离子自正在基的排除,铁还原,铁螯合影响和脂 质过氧化影响。 DPPH 自正在基排除才力最强的是酸性丙酮 (MeAA) , 到达了 1390± CE 29.6mg/ 100 g FW, 而最低的是甲醇 (MeM) 溶液, 唯有 421± 21.3 mg CE/100 g f.w., 正在酸性甲醇和丙酮中自正在基的排除才力适中(外 1) 。使用 ABTS 手段对生果相对 抗氧化活性的切磋是用来排除 ABTS 阳离子自正在基爆发的氧化 ABTS 离子。 观测结 果显示正在通盘的 ABTS 排除活性水准较高提取物是 MEAA,到达了 1,252± 23.7mgBHAE/100 g f.w,最低的是 MeM,到达了 569± 11.9 mg BHAE/100 g f.w。正在 MAM 和 MeA 中 ABTS 排除活性水准中等。超氧离子是通过正在代谢进程中氧 分子落空一个电子爆发的,超氧离子是其他自正在基的苛重根源。以是,查验喜玛 朗雅山杨梅的提取物看待超氧自正在基阴离子的排除才力具有十分苛重的意思。 我 们的观测结果显示,看待超氧自正在基阴离子的排除才力最强的是用 MeAA 提取出 来的喜玛朗雅山杨梅的提取物,到达了 1,611.6± 48.2 mg AAE/100 g f.w.而排除能 力最弱的是 MeM 提取出来的,到达了 567± 28.9 mg AAE/100g f.w.(外 1) 。铁还原 法是测定喜玛朗雅山杨梅的提取物将三价铁转化成二价铁的才力。用 MeAA 提取 的提取物浮现了最高的铁还原才力,到达了 1,070± 30.7 mg AAE/100 g f.w.而用 MeM 提取出来唯有 305.3± 9.3 mg AAE/100 g f.w.。令人骇怪的是,没有正在任何一 种喜玛朗雅山杨梅的提取物中检测到了铁螯合活性。 看待自正在基的排除才力和铁 还原举动,其巨细规律为 MeAAMeAMeAMMeM。喜玛朗雅山杨梅的提取物 消亡自正在基的才力和还原铁的才力与它的众酚类物质和类黄酮化合物的彼此作 用是密弗成分的 (外二) 。β -胡萝卜素漂白试验是权衡一个化合物或同化物强迫 脂质过氧化影响才力的一种十分简单的手段,道理是亚油酸过氧化自正在基介导 β —胡萝卜素被化合物强迫。以是,β -胡萝卜素的漂白率是与提取物与正在这个 体例中变成的亚油酸过氧化氢自正在基中和的抗氧化活性成反比的。 通盘 4 种提取 物通过亚油酸过氧化氢自正在排除脂质发现了很强的大的强迫影响。然而,正在把握 畛域内,BHA 水准,与 MEM 比拟,其他三种提取物发现了更强的强迫影响(图 1) 。 外 1:喜玛朗雅山杨梅果实提取物众酚含量与抗氧化活性 外 2:喜玛朗雅山杨梅果实提取物中的酚类化合物和黄酮类化合物对自正在基的清 除和还原铁的才力举行回归理解 图 1:喜玛朗雅山杨梅果实提取物对β -胡萝卜素漂白影响的强迫影响 抗癌活性:采用 MTT 比色理解法来切磋喜玛朗雅山杨梅果实提取物对宫 颈癌三种细胞(C33A,SiHa 和 HeLa 细胞系) 、寻常转化细胞(HEK293)和非 寻常转化细胞(PBMCs)的毒性影响。用 66.7, 166.5, 333, 500, and 667 ug of f.w./100 uL 举行细胞原代提拔。通盘的 4 种提取物都对宫颈癌细胞有着明明的抑 制影响,出现出非癌细胞、没有细胞毒性的细胞和非转化细胞(图 2) 。因为提 取物和细胞株的差别,它的强迫影响也不雷同,看待 C33A 细胞通盘喜玛朗雅山 杨梅果实提取物最敏锐的畛域的切磋,正在提取液浓度为 667ug FW / 100uL 时, MeM 和 MeAM 能够低浸 C33A 细胞分离存活率低浸至 20%和 22%,他们十分好 的强迫了 C33A 细胞的分开的 80%和 78%(图 2A) 。然而 MEA 和 MEAA 提取物也 能起到犹如的强迫影响,能够将 C33A 细胞分离低浸至 80%和 72%。当提取物浓 度正在 333ug FW / 100uL 时, 最大强迫率为 92 和 90%, 如外 3 所示, 浓度为 29.40ug f.w./100 uL 的 MEA 和浓度为 f.w./100 uLMEAA 提取液与浓度为 164.7ug f.w./100 uL 的 MEM 和 353.4ug f.w./100 uLMEAM 提取液为最适的强迫浓度。SiHa 细胞 系对喜玛朗雅山杨梅果实提取物最敏锐的转变畛域是:正在提取液浓度为 667ug FW / 100uL 时,MeA 和 MeAA 看待该细胞增殖的最大强迫率为 78%和 84%,这 比同浓度下, MeM 和 MeAM 的最大强迫率 50%和 60%好的众。 它们的最适的抑 制浓度分离是: MeA 为 439.37ug FW / 100uL;MeAA 为 360.88ug FW / 100uL;MeM 为 651.80ug FW / 100uL;MeAM 为 565.59ug FW / 100uL。 正在浓度低至 165.5ug FW / 100uL 时,HeLa 细胞并没有显示出对 MeM 和 MeAM 的敏锐性。然而正在浓度为 667ug FW / 100uL 时 MeA 和 MeAA 分离看待该细胞存活率为 56%和 61%, 看待 该细胞增殖的最大强迫率分离为 44%和 39%。比拟之下,MeA 和 MeAA 能够将 HeLa 细胞的存活率降至 48%和 57%,细胞增殖的强迫率到达 52%和 43%。正在提取 物浓度为 667ug FW / 100uL,MeA 和 MeAA 浓度对 HeLa 细胞增殖的强迫率达 到 80 和 70%。 它们的最适的强迫浓度分离是: MeA 为 400.32ug FW / 100uL;MeAA 为 458.11ug FW / 100uL;MeM 为 816.92ug FW / 100uL;MeAM 为 931.57ug FW / 100uL。 当咱们把百般提取物举行抗癌理解, 相看待它们的酚类物质和黄酮含量, 咱们觉察它们的抗增殖活性和总酚含量 (R2 = 0.464) 或黄酮类化合物的含量 (R2 = 0.549)的没有明明的相干性。如图 2D 和图 2E 所示,与宫颈癌细胞系变成光鲜 比较的是,通盘的 4 种喜玛朗雅山杨梅果实提取物对寻常转化细胞 (HEK293) 和 非寻常转化细胞 (PBMCs) 没有毒副影响, 而不是正在最高浓度为 667ug FW / 100uL, 煽动其增值到达 20%的 MEA 提取液。MEA 提取液对发展的煽动影响明明优于 其他几种溶液提取出来的提取物。 这些数据真切的注解喜玛朗雅山杨梅果实提取 物对宫颈癌的细胞株增殖活性具有选取性。 (A)


back

0898-66558888

90cake@qq.com

北京市朝阳区沿江中路298号江湾商业中心26楼2602-2605

简要介绍   新闻资讯   产品展示   技术服务   人才资源   联系我们  



Copyright © 2019 大地彩票生物科技有限公司 版权所有   网站地图